最近被医院安排到医务科轮转，所以看文献的时间明显多了起来。这是北大BIOPIC张泽民教授发表的一篇《Cell》1，通过对单细胞水平的RNA测序结果以及T细胞受体序列进行解读，确立了11个T细胞亚群，并对肝细胞肝癌患者瘤旁正常组织、外周血液中的淋巴细胞以及肿瘤组织浸润淋巴细胞中各亚群的关系、功能状态等进行了分析，重点关注了肿瘤浸润淋巴细胞中的耗竭性CD8 + T细胞以及Tregs。
免疫治疗是肿瘤治疗中的一个热门研究方向，如免疫检查点阻断治疗，虽然在临床取得了显著的疗效，但是在不同的肿瘤患者及不同类型的肿瘤中，其疗效并不一致。所以我们需要找到一个稳定的生物标志物来对疗效进行预测。
既往研究使用的一些标志物，如肿瘤细胞突变负荷、肿瘤浸润淋巴细胞水平以及药物靶点的表达等，其稳定性仍不足以作为临床生物标志物进行应用。作者认为，对肿瘤组织驻留T细胞(tumor-resident T cells)的深入解读，是开发新的肿瘤免疫治疗方法以及有效的生物标志物的关键点，因为：
- 通过对来自直肠癌等组织中的浸润调节性T细胞(Tregs)的转录组学分析，发现这些细胞处于较强的抑制功能状态。
- 免疫检查点阻断治疗可以通过发动肿瘤微环境中的CD8 +细胞毒性T细胞来发挥作用，但是其细胞毒性作用可被Treg抑制或者因进入T细胞耗竭状态而抑制。
作者进一步认为，对肿瘤浸润淋巴细胞中的耗竭性CD8 + T细胞以及Tregs在肿瘤中富集的调控机制和通路进行挖掘，可能改善肿瘤免疫治疗策略。
研究方法上，作者选择了单细胞转录组学分析：
- 单细胞技术允许对复杂的肿瘤微环境中的浸润性淋巴细胞进行详细分析；
- 单细胞RNA测序可以对单个细胞的T细胞受体(TCR)序列进行分析，通过TCR序列可以提供关于T细胞克隆扩增及T细胞谱系的详细信息。
研究对象上，作者选择了肝细胞肝癌（HCC）中的浸润淋巴细胞：
- HCC缺乏临床有效的免疫治疗措施；
- HCC瘤体中有大量淋巴细胞浸润，但是这些淋巴细胞缺乏杀死肿瘤细胞的能力，从而成为对肿瘤浸润淋巴细胞功能调节异常进行研究的一个具有吸引力的模型。
研究使用的样本为：
- 外周血（P）
- 肿瘤组织（T）
- 瘤旁正常组织（N） ：与肿瘤距离≥2cm
其研究设计如下：
首先通过Bulk DNA/RNA-seq对肿瘤组织细胞的基因组学特征进行分析，证实所采用的组织来自肝细胞肝癌，随后利用免疫组化证实癌组织中有大量浸润淋巴细胞，并利用及Opal multicolor IHC staining技术对浸润淋巴细胞亚群的分布进行了可视化展示，证实了作者前面提到的“HCC是一个具有吸引力的模型”的说法。
然后，将血液/组织样本分别制备成细胞悬液，通过细胞分选技术将其中的淋巴细胞分成以下三类：
- CD8 +: Cytotoxic T cells (TC)
- CD4 +CD25 –: T helpers (TH)
- CD4 +CD25 high: Tregs (TR)
并将获得的5,063个单个细胞的转录组测序后进行了聚类分析，发现了以下现象：
- TTC cells clustered closely with NTC
- PTC cells fell into two apparent clusters
- TTH cells exhibited high degree of diversity with a small fraction resembling TTR cells.
这提示了进一步对单细胞转录组测序信息进行分析的必要性，并进一步将这些T细胞分成了11个亚群：
- CD8 +: 5 clusters
- CD4 +: 6 clusters
并对这11个亚群的特征基因以及在P/N/T中的分布情况进行了分析，最终将其关注重点放在了HCC-Infiltrating Tregs 和 Exhausted CD8 + T Cells上，因为：
- Preferential enrichment of CTLA4high Tregs and exhausted CD8 cells in HCC
- Co-inhibitory receptors, such as PDCD1 and TIGIT, expressed by these two T cell subsets are targets for cancer immunotherapies
他们发现了401个在肿瘤浸润行Tregs中及82个在耗竭性T细胞中特征性表达的基因。随后通过单细胞水平的TCR分析，对不同T细胞之间的关系以及肿瘤浸润性T细胞的来源进行揭示，他们认为：
- The clonal accumulation of both Tregs and CD8 T cells was a result of local T cell proliferation and activation in the tumor environment
- We could not formally rule out the possibility that these local T cells were amplified in the peripheral lymph organs and then migrated into tumors
作者将其获得的单细胞水平的转录组数据及TCR信息通过Pseudotime analysis, EMBEDDR, SCORPIUS,TSCAN对T细胞的功能状态以及developmental trajectories进行了分析，发现签署的exhausted CD4 和 CD8 T cells 似乎是处于效应细胞和耗竭T细胞(effector and exhausted T cells)之间的中间态，并觉得促进这些细胞向效应状态而非耗竭状态状态转化，可能是一种新的靶向治疗措施。
研究者们发现肿瘤中的CD8 T细胞大多处于耗竭状态，而晚期患者中处于耗竭状态的CD8细胞比例比非耗竭状态的细胞明显更高，通过对这些耗竭状态的CD8 细胞和Tregs的进一步分析，作者认为：
- 肿瘤微环境会促进浸润CD8+ T细胞进入耗竭状态以及功能抑制状态
- 肿瘤中耗竭状态CD4T细胞会向肿瘤特异性的Tregs转化的潜能及Tregs在肿瘤中的富集
这可能是机体免疫状态和肿瘤浸润T细胞的杀伤能力受到抑制的原因。
研究者们认为本研究的亮点在于：
- Single-cell RNA-seq reveals distinctive functional composition of T cells in HCC
- Clonal enrichment of infiltrating Tregs and exhausted CD8 T cells in HCC
- LAYN is linked to the suppressive function of tumor Treg and exhausted CD8 T cells
- Combined expression and TCR-based analyses show connectivity among T cell subsets
目前口腔肿瘤免疫治疗的研究中，国内的很多课题组仍然把目光放在肿瘤相关巨噬细胞上，因为有成熟的细胞系和研究套路；也有课题组在做CAR T-cell therapy以及免疫检查点抑制剂方面的研究尝试。免疫治疗已逐渐成为手术、放疗和化疗外的第四种肿瘤治疗方式，所以在口腔肿瘤中进行肿瘤浸润性T细胞特征分析以及在肿瘤发生发展和治疗中的作用的研究或许会成为未来的一个热点。另外张泽民教授2021年在《Science》发表了一篇规模更宏大的关于肿瘤浸润性T细胞图谱的研2。
-
Zheng C, Zheng L, Yoo JK, Guo H, Zhang Y, Guo X, Kang B, Hu R, Huang JY, Zhang Q, Liu Z, Dong M, Hu X, Ouyang W, Peng J, Zhang Z. Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing. Cell. 2017 Jun 15;169(7):1342-1356.e16. doi: 10.1016/j.cell.2017.05.035. PMID: 28622514. ↩
-
Zheng L, Qin S, Si W, Wang A, Xing B, Gao R, Ren X, Wang L, Wu X, Zhang J, Wu N, Zhang N, Zheng H, Ouyang H, Chen K, Bu Z, Hu X, Ji J, Zhang Z. Pan-cancer single-cell landscape of tumor-infiltrating T cells. Science. 2021 Dec 17;374(6574):abe6474. doi: 10.1126/science.abe6474. Epub 2021 Dec 17. PMID: 34914499. ↩